組織培(pei)養細(xi)胞的(de)裂解(jie)

 

    在(zai)某些情(qing)況下(xia)，需(xu)要(yao)較劇(ju)烈(lie)的(de)抽提條件以釋(shi)出(chu)所(suo)研究的(de)抗原(yuan)或除(chu)去(qu)微弱(ruo)的(de)相關(guan)蛋白(bai)。此時(shi)，推薦(jian)使用(yong)RIPA裂(lie)解(jie)緩(huan)沖(chong)液，該體(ti)系(xi)含(han)離(li)子型和(he)非(fei)離(li)子型去(qu)汙(wu)劑，具有相當大(da)的(de)變(bian)性能(neng)力(li)。除細(xi)胞內不溶性蛋(dan)白(bai)外所(suo)有(you)可溶(rong)性蛋(dan)白(bai)分(fen)子均可釋(shi)出(chu)，並(bing)能(neng)破壞大(da)部分非(fei)共價的(de)相互作用(yong)。

 

    除(chu)非有特殊原(yuan)因(yin)，推薦(jian)在裂(lie)解(jie)緩(huan)沖(chong)體(ti)系(xi)中(zhong)加(jia)入蛋白(bai)酶(mei)抑制(zhi)劑混合液(ye)。在(zai)新抗原(yuan)研究的(de)早期(qi)使用(yong)蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑制(zhi)劑總是有(you)利(li)的(de)。在該蛋(dan)白(bai)已(yi)被定(ding)性後，可以(yi)進(jin)行實(shi)驗以了(le)解(jie)這些(xie)抑制(zhi)劑是否(fou)在所(suo)有(you)情(qing)況下(xia)都(dou)必(bi)需。如(ru)前(qian)所(suo)述(shu)，終(zhong)止(zhi)蛋(dan)白(bai)酶(mei)作(zuo)用(yong)的(de)方法(fa)是在(zai)免(mian)疫(yi)沈(chen)澱(dian)的(de)全(quan)部過程(cheng)中(zhong)溶(rong)液(ye)保(bao)持(chi)低溫(wen)。

 

    如果研究經(jing)磷酸化修(xiu)飾的(de)蛋白(bai)質時(shi)，應考慮(lv)加(jia)入磷酸酶(mei)抑制(zhi)劑。

    1．準備(bei)工作(zuo)

    由(you)於(yu)免疫(yi)沈(chen)澱(dian)有(you)多(duo)個(ge)步(bu)驟(zhou)，且(qie)包括數小(xiao)時(shi)孵育，因(yin)此在實(shi)驗開始(shi)前必(bi)須安(an)排好時(shi)間，註意適當利(li)用(yong)過(guo)夜孵育的(de)時(shi)間間隔。這將(jiang)有助於(yu)決定(ding)何時(shi)開始(shi)裂解(jie)細胞(bao)。

    2．所(suo)需(xu)溶(rong)液(ye)

    PBS，裂(lie)解(jie)緩(huan)沖(chong)液（4℃預冷）。

    3．操作步驟(zhou)

    （1）單(dan)層細胞的(de)培(pei)養，用(yong)室(shi)溫(wen)PBS洗細胞(bao)壹次，然後甩(shuai)幹；懸浮培(pei)養的(de)細胞(bao)，400g離(li)心10min，收(shou)集細胞棄上清(qing)液。

   （2）對於(yu)單層(ceng)細胞培(pei)養，將(jiang)培(pei)養瓶(ping)置於(yu)冰上，每(mei)lOOmm培(pei)養瓶(ping)加(jia)入1 mL溶解(jie)緩(huan)沖(chong)液（4℃預冷）；對於(yu)懸浮(fu)培(pei)養，將(jiang)盛(sheng)細胞(bao)團的(de)試(shi)管(guan)置於(yu)冰上。按10⁷個細(xi)胞加入1．0ml裂解(jie)液（4℃預冷）。

    保(bao)存(cun)在冰箱(xiang)的(de)裂解(jie)液可隨(sui)時(shi)使用(yong)。

    （3）冰上放置3min，不時(shi)敲(qiao)擊(ji)貼壁細(xi)胞培(pei)養瓶(ping)，或(huo)輕搖(yao)懸浮(fu)培(pei)養細(xi)胞。

    （4）對於(yu)單層(ceng)細胞培(pei)養，敲(qiao)擊(ji)培(pei)養瓶(ping)數(shu)次，混合均勻，在(zai)冰床(chuang)上傾(qing)斜(xie)培(pei)養瓶(ping)使溶液(ye)集中(zhong)於(yu)壹側(ce)，然後將(jiang)裂解(jie)物移置另(ling)壹(yi)支(zhi)1．5mL圓錐形(xing)試(shi)管(guan)。有些(xie)研究者(zhe)喜歡(huan)從(cong)瓶(ping)壁(bi)刮取細(xi)胞，但(dan)除特殊要求(qiu)外此舉並(bing)非必須(xu)。

    （5）單層培(pei)養的(de)細胞(bao)或(huo)懸(xuan)浮培(pei)養的(de)細胞(bao)均以10 000g，413離(li)心10min，仔(zai)細(xi)吸取(qu)上清(qing)液盛(sheng)於(yu)另(ling)壹(yi)試(shi)管(guan)，不可攪(jiao)動(dong)細(xi)胞團。置冰上。

此時(shi)，上清(qing)液可用(yong)於(yu)下壹(yi)步的(de)預處理。

 

    4．常見(jian)問(wen)題   

    上述(shu)程序zui普遍(bian)的(de)問題(ti)是抗原(yuan)不*從(cong)細胞內釋(shi)放。可以(yi)通(tong)過(guo)對裂解(jie)液和(he)細(xi)胞(bao)殘渣進(jin)行免(mian)疫印(yin)跡(ji)來檢查(zha)抗原(yuan)是否(fou)*釋(shi)放。改變(bian)裂解(jie)液所(suo)用(yong)的(de)去(qu)汙(wu)劑是增(zeng)加抗原(yuan)釋(shi)放的(de)zui有效(xiao)方法(fa)。

    機(ji)械(xie)性剪(jian)切(qie)也(ye)可破(po)壞(huai)細(xi)胞膜(mo)，常見(jian)的(de)方法(fa)包括使用(yong)超(chao)聲波發生(sheng)器、Dounce勻漿(jiang)器、波(bo)特(te)器和(he)攪(jiao)拌(ban)器等(deng)。這些(xie)方(fang)法(fa)特別(bie)適(shi)用(yong)於(yu)大體(ti)積(ji)制(zhi)備(bei)或需(xu)避免使用(yong)去(qu)汙(wu)劑時(shi)。在這些(xie)方(fang)法(fa)中(zhong)，zui溫(wen)和的(de)方法(fa)是使用(yong)Dounce勻漿(jiang)器，但(dan)僅(jin)適(shi)合於(yu)較大(da)體(ti)積(ji)的(de)標(biao)本(ben)（數(shu)毫(hao)升或(huo)更(geng)多(duo)）。

    壹般不推薦(jian)凍(dong)融法，因(yin)反(fan)復(fu)凍(dong)融會使蛋白(bai)質過量(liang)降(jiang)解(jie)，其原(yuan)因(yin)不明。除(chu)非(fei)所(suo)研究的(de)抗原(yuan)特別(bie)能(neng)耐受蛋(dan)白(bai)水(shui)解(jie)作用(yong)或(huo)者(zhe)事先已測試(shi)過(guo)該方(fang)法(fa)，壹般不作為(wei)。通(tong)常，用(yong)去(qu)汙(wu)劑裂解(jie)是免(mian)疫(yi)沈(chen)澱(dian)的(de)方法(fa)。