利(li)用(yong)玻(bo)璃微(wei)珠(zhu)裂(lie)解(jie)酵(jiao)母(mu)細胞

 

    1．準備工(gong)作(zuo)

    由於免疫沈澱(dian)有多(duo)個(ge)步驟，且包括數(shu)小時(shi)孵(fu)育(yu)，因(yin)此(ci)在(zai)實(shi)驗(yan)開始(shi)前(qian)必須安(an)排好(hao)時間，註意適(shi)當利(li)用(yong)過(guo)夜(ye)孵(fu)育(yu)的(de)間隙(xi)。這將有助(zhu)於決(jue)定(ding)何(he)時(shi)開始(shi)裂(lie)解(jie)細胞。同(tong)時(shi)應(ying)註意，

酵(jiao)母(mu)菌免疫沈澱(dian)的(de)本(ben)底水平(ping)非常高(gao)，因(yin)此(ci)推(tui)薦(jian)進(jin)行預處(chu)理和使用蛋白(bai)酶。

 

    2．所(suo)需(xu)溶(rong)液(ye)

    PBS，裂(lie)解(jie)緩沖(chong)液(ye)（含(han)有蛋白(bai)酶抑制劑，置(zhi)冰上(shang)預冷(leng)），玻璃微(wei)珠(zhu)（500umol／L，冷(leng)藏）。

 

    3．操作(zuo)步(bu)驟

    （1）4000g離(li)心(xin)5min收(shou)集酵(jiao)母(mu)菌，去(qu)上清液(ye)。重(zhong)懸浮(fu)於(yu)PBS，離(li)心(xin)，棄(qi)去PBS。

    （2）將酵(jiao)母(mu)團再(zai)次(ci)懸浮於少量預冷(leng)的(de)裂(lie)解(jie)液(ye)。通常用大(da)約(yue)3倍體積(ji)的(de)RIPA緩(huan)沖液(ye)（150mmol／L NaCl、1％NP-40、0．5％脫(tuo)氧(yang)膽酸(suan)鈉、0．1％SDS和50mmol／L Tris，pH8．0）。同(tong)時(shi)應加入(ru)蛋白(bai)酶抑制劑。置(zhi)冰上(shang)。

    （3）玻(bo)璃微(wei)珠(zhu)（直(zhi)徑500~mol／L），用1mol／I鹽(yan)酸和裂(lie)解(jie)緩沖(chong)液(ye)分(fen)別(bie)洗滌(di)2次(ci)。然後(hou)置(zhi)於少(shao)量裂(lie)解(jie)緩沖(chong)液(ye)內(nei)，413保(bao)存。

    （4）在(zai)重(zhong)懸浮(fu)的(de)酵(jiao)母(mu)細胞內(nei)加入(ru)等(deng)體積(ji)預冷(leng)的(de)玻(bo)璃微(wei)珠(zhu)。

    （5）劇(ju)烈渦(wo)流(liu)振(zhen)蕩30s，重(zhong)復(fu)操作(zuo)直(zhi)至(zhi)大(da)部(bu)分(fen)酵(jiao)母(mu)細胞裂(lie)解(jie)。

    （6）將細胞裂(lie)解(jie)物連同(tong)玻(bo)璃微(wei)珠(zhu)以(yi)10 000g離(li)心(xin)5min。仔(zai)細吸(xi)取(qu)上(shang)清液(ye)盛(sheng)於(yu)另(ling)壹(yi)試(shi)管(guan)，置(zhi)冰上(shang)。

此(ci)時(shi)，上清液(ye)可(ke)以(yi)用於下壹(yi)步預處(chu)理。

 

    4．常見(jian)問(wen)題(ti)

    該(gai)方法(fa)常見(jian)問(wen)題(ti)是蛋白(bai)質(zhi)抗原的(de)變(bian)性(xing)。解決(jue)方(fang)法是用(yong)某些能破壞(huai)細胞壁的(de)酶(mei)處理酵(jiao)母(mu)菌使其形成(cheng)原(yuan)生質(zhi)體，然後(hou)再用去汙劑將其裂(lie)解(jie)。這是壹(yi)個(ge)有效(xiao)的(de)方(fang)法，但(dan)酶(mei)的(de)價(jia)格(ge)昂(ang)貴，限(xian)制了該(gai)方法(fa)常規應用於大(da)容(rong)量標本(ben)的(de)制備。然而對於所(suo)研究的(de)關(guan)鍵蛋白(bai)的(de)精(jing)細分(fen)析(xi)，仍不失(shi)為壹個(ge)有效(xiao)的(de)方(fang)法。