單(dan)核(he)細(xi)胞分離原理(li)、方(fang)法(fa)及要點(dian)

基(ji)本原理(li)：本文分離單(dan)核(he)細(xi)胞所用(yong)方(fang)法(fa)是(shi)Percoll非(fei)連(lian)續性(xing)密度梯度離心法(fa)，主要是(shi)根(gen)據(ju)不(bu)同(tong)細(xi)胞間密(mi)度的(de)差別進(jin)行細(xi)胞分離。此法(fa)易操作(zuo)，且(qie)使(shi)用(yong)通(tong)常的(de)實(shi)驗設備即(ji)可(ke)完(wan)成。

試劑與器(qi)材(cai)

1）外周血(xue)單(dan)個核(he)細(xi)胞

2）1×PBS和(he)10×PBS（無Ca2+、Mg2+，0.5mM EDTA），胎(tai)牛(niu)血(xue)清（56℃，30分鐘加(jia)熱(re)滅(mie)活(huo)），HCl1mol/L。

Percoll分層液(ye)（密(mi)度=1.130g/ml,商品(pin)），4g/L臺盼藍染(ran)液(ye)（溶(rong)解(jie)在PBS液(ye)中）。

3）50ml聚丙(bing)烯圓錐管，毛細(xi)吸(xi)管，移液管（1、2、10ml）。

4）CO2孵箱(xiang)，超(chao)凈臺，有旋(xuan)轉(zhuan)桶(tong)轉(zhuan)子裝(zhuang)置(zhi)的(de)離心(xin)機(ji)，PH計。

操作(zuo)步(bu)驟(zhou)——所(suo)有(you)的(de)操作(zuo)應(ying)該(gai)在無(wu)菌(jun)條件下進(jin)行

（壹）不(bu)同(tong)密(mi)度Percoll分層液(ye)的(de)配制(zhi)

1.Percoll分層液(ye)儲(chu)備液(ye)的(de)制備：取(qu)未(wei)稀釋(shi)的(de)Percoll原液（從(cong)瓶(ping)中取）9ml+1ml 10×PBS（無(wu)Ca2+、Mg2+），用(yong)HCl 調(tiao)節PH至(zhi)7.4

2. Percoll分層液(ye)（Ⅰ）（密(mi)度=1.080g/ml）的(de)配制(zhi)：取(qu)Percoll儲(chu)備液(ye)3.12 ml（前(qian)壹步(bu)配制(zhi)）+1.88ml 1× PBS1（無(wu)Ca2+、Mg2+）

3. Percoll分層液(ye) （Ⅱ）（密(mi)度=1.069g/ml）的(de)配制(zhi)：取(qu)Percoll分層液(ye)（Ⅰ）2.68 ml+2.32ml1×PBS（ 無(wu)Ca2+、Mg2+）

4. Percoll分層液(ye)（Ⅲ）（密(mi)度=1.060g/ml）的(de)配制(zhi)：取(qu)Percoll分層液(ye)（Ⅱ）2.32 ml +2.68 ml1×PBS（無(wu)Ca2+、Mg2+）

（二(er)）不(bu)連(lian)續(xu)密(mi)度梯度制備

1.將(jiang)洗滌(di)過(guo)的(de)8×107外周血(xue)單(dan)個核(he)細(xi)胞重新懸浮在2ml的(de)Percoll分層液(ye)（Ⅰ）（密(mi)度=1.080g/ml）在這(zhe)層液(ye)體的(de)表面(mian)上(shang)輕(qing)輕(qing)鋪上2mlPercoll分層液(ye)（Ⅱ）（密(mi)=1.069g/ml），後再於(yu)第(di)二(er)層液(ye)面(mian)上(shang)輕(qing)輕(qing)鋪上2ml的(de)Percoll分層液(ye)（Ⅲ）（密(mi)度=1.060g/ml）

2. 20℃，在旋轉轉(zhuan)子中1000×g離(li)心(xin)上步(bu)所(suo)形(xing)成的(de)密度梯度90分鐘（慢(man)慢(man)增(zeng)加(jia)速度，無制動停(ting)轉(zhuan)）。

（三(san)）單(dan)核(he)細(xi)胞的(de)分離

1. 離(li)心(xin)後單(dan)核(he)細(xi)胞存(cun)在於(yu)Percoll分層液(ye)（Ⅱ）和(he)（Ⅲ）（密度較小的(de)部分）之間的(de)界面(mian)中(zhong)。

2. 用(yong)毛(mao)細(xi)吸(xi)管仔細(xi)收集(ji)單(dan)核(he)細(xi)胞。

3. 用(yong)含1-5%胎(tai)牛(niu)血(xue)清的(de) 1×PBS液洗滌(di)細(xi)胞3次，4℃，400×g離心(xin)5分鐘，棄上清液。

4. 若(ruo)需要進(jin)壹步(bu)實(shi)驗，將細(xi)胞重新懸浮於(yu)培養基(ji)中。

5. 用(yong)臺盼藍拒(ju)染(ran)法(fa)測定細(xi)胞存(cun)活(huo)率(lv)。

結(jie)果：本(ben)法(fa)回收的(de)細(xi)胞中單(dan)核(he)細(xi)胞占70-100%（存(cun)活(huo)率(lv)應(ying)大於(yu)90%），淋巴(ba)細(xi)胞占0-20%，粒(li)細(xi)胞占0-5%，紅(hong)細(xi)胞占0-7%，血(xue)小(xiao)板(ban)小(xiao)於(yu)0.5%。

實(shi)驗要點(dian)

1.為(wei)了(le)得(de)到(dao)較(jiao)好的(de)結(jie)果，外周血(xue)單(dan)個核(he)細(xi)胞分離後應立(li)即(ji)使用(yong)。

2.所(suo)有操(cao)作過(guo)程應在18-20℃中進行。

3.仔細(xi)覆(fu)蓋(gai)各種Percoll分層液(ye)，避(bi)免(mian)破(po)壞其界(jie)面(mian)。

4.洗滌(di)分離細(xi)胞3次，以(yi)除去(qu)殘存(cun)的(de)Percoll分層液(ye)和(he)血(xue)小(xiao)板(ban)。

5.如(ru)果所(suo)制(zhi)備的(de)細(xi)胞仍不(bu)純(chun)，可(ke)使(shi)用(yong)包被有(you)抗(kang)CD2、抗(kang)CD3、抗(kang)CD19抗(kang)體分子的(de)磁珠，以(yi)除去(qu)殘存(cun)的(de)NK、T、B淋巴(ba)細(xi)胞。