免(mian)疫(yi)親和(he)純化的操(cao)作步驟(zhou)

    純化率(lv)為1000～10 000倍。

    快(kuai)速(su)純化抗原，層析柱常(chang)可重復使(shi)用(yong)。

    可獲(huo)得(de)純化的抗(kang)原。

    不(bu)能(neng)用於定(ding)量測(ce)定(ding)。

    純化效(xiao)果取(qu)決(jue)於抗原的濃度和(he)抗體的親和力(li)

    需(xu)要適當純化的抗(kang)體。

 

    2．操(cao)作步驟(zhou)

    (1)將(jiang)抗體結合到蛋(dan)白(bai)A或蛋(dan)白(bai)G微(wei)珠(zhu)上(shang)。對於壹般用途(tu)的(de)層析柱，每(mei)毫(hao)升(sheng)濕的微(wei)珠(zhu)大約(yue)可以結(jie)合(he)2mg單(dan)克隆(long)抗(kang)體或親和純化的多(duo)克(ke)隆(long)抗體。將(jiang)抗體和蛋白(bai)A或蛋(dan)白(bai)G微(wei)珠(zhu)混(hun)合(he)制成稀(xi)薄(bo)的(de)勻(yun)漿，在(zai)總(zong)量為10ml的溶(rong)液中(zhong)加入大約(yue)lml微(wei)珠(zhu)，室(shi)溫(wen)孵(fu)育(yu)1h，輕輕(qing)搖(yao)動混(hun)勻。

    (2)用10倍(bei)體積(ji)的(de)0．2mol／L硼(peng)酸(suan)鈉(pH9．0)洗(xi)滌(di)微(wei)珠(zhu)2次(ci)，每(mei)次(ci)以3000g離(li)心(xin)2rain或(huo)10 000g離(li)心(xin)30s。  

    (3)用(yong)10倍(bei)體積(ji)的(de)0．2mol／L硼(peng)酸(suan)鈉(pH9．0)重(zhong)懸微(wei)珠(zhu)，留(liu)取(qu)相(xiang)當(dang)於10t~l濕微(wei)珠(zhu)的(de)樣(yang)品(pin)。加入足量的二甲(jia)基庚(geng)二酸(suan)酯(固體)至(zhi)微(wei)珠(zhu)勻(yun)漿(jiang)中，使(shi)終(zhong)濃度為20mmol／L。

    (4)室溫(wen)孵(fu)育(yu)30min，並輕(qing)輕混勻(yun)。留(liu)取(qu)相(xiang)當(dang)於10t~l偶(ou)聯(lian)微(wei)珠(zhu)的(de)樣(yang)品(pin)。

    (5)用0．2mol／L乙醇(chun)胺(an)(pH8．0)洗滌微(wei)珠(zhu)1次(ci)以終(zhong)止(zhi)反(fan)應(ying)。然後(hou)重(zhong)懸於0。2mol／L乙醇(chun)胺(an)，室溫孵(fu)育(yu)2h，輕輕(qing)混(hun)勻(yun)。微(wei)珠(zhu)用(yong)PBS洗(xi)滌後，重懸於PBS，加入硫(liu)柳(liu)汞保存(cun)。

    (6)將(jiang)偶(ou)聯(lian)前(qian)和偶(ou)聯(lian)後的微(wei)珠(zhu)樣(yang)品(pin)加入Laemmli樣(yang)品(pin)緩沖液中(zhong)煮(zhu)沸後(hou)，檢(jian)查(zha)偶(ou)聯(lian)效(xiao)果。分別(bie)取(qu)相(xiang)當(dang)於1ul和9ul 2份(fen)樣(yang)品(pin)在(zai)10％SDS—聚(ju)丙烯(xi)酰胺(an)凝(ning)膠(jiao)中(zhong)電泳(yong)，並用(yong)考馬斯(si)亮(liang)藍染(ran)色，偶(ou)聯(lian)效(xiao)果良(liang)好時，在(zai)偶(ou)聯(lian)前(qian)的微(wei)珠(zhu)樣(yang)品(pin)中顯示(shi)壹(yi)條55kDa的(de)重(zhong)鏈帶(dai)，而偶(ou)聯(lian)後的樣(yang)品(pin)無此區帶(dai)。

    (7)將(jiang)抗體包(bao)被的微(wei)珠(zhu)轉(zhuan)入合適(shi)的層析柱中，用(yong)PBS沖洗容(rong)器，收集殘留(liu)的(de)微(wei)珠(zhu)。如(ru)果(guo)可能(neng)，僅使(shi)用(yong)結合制(zhi)品(pin)中全部抗(kang)原所需(xu)的(de)抗(kang)體微(wei)珠(zhu)基(ji)質(zhi)。

    (8)用20倍柱床體積(ji)與(yu)制備(bei)抗原相(xiang)同(tong)的(de)緩沖液洗(xi)柱(zhu)。

    (9)將(jiang)抗原液加到(dao)柱上(shang)，按(an)每(mei)毫(hao)升(sheng)柱體積(ji)大約(yue)lml／h的速(su)度使(shi)抗(kang)原溶(rong)液流(liu)過(guo)層析柱，可以用(yong)壹(yi)臺(tai)蠕動泵控制(zhi)。

    (10)用(yong)20倍柱床(chuang)體積(ji)的(de)結(jie)合緩沖液(PBS)洗(xi)柱(zhu)。

    (11)用(yong)20倍柱床(chuang)體積(ji)的(de)預(yu)洗脫緩沖液洗(xi)柱(zhu)。建(jian)議使(shi)用(yong)預洗脫(tuo)緩沖液。

    (12)采(cai)用分段(duan)洗(xi)脫法(fa)，連(lian)續以0．5倍(bei)柱(zhu)床體積(ji)的(de)洗(xi)脫緩沖液通(tong)過(guo)層析柱，分管(guan)收(shou)集每(mei)壹(yi)組分。如(ru)果(guo)用過高(gao)或(huo)過(guo)低(di)pH值(zhi)的緩沖液洗(xi)脫(tuo)，收(shou)集管內(nei)需(xu)加入0。1倍柱(zhu)床體積(ji)的(de)緩沖液

    (13)檢(jian)測(ce)每(mei)管(guan)的抗原含(han)量，將(jiang)濃度高(gao)的(de)各管合並。根據抗原的用途，需(xu)對獲(huo)得(de)的蛋白(bai)洗脫(tuo)液透析以改(gai)變(bian)緩沖液。

    (14)用(yong)20倍(bei)柱(zhu)床體積(ji)的(de)起始(shi)緩沖液流(liu)經基(ji)質(zhi)，使(shi)層析柱再(zai)生。加入0．01％硫(liu)柳(liu)汞可長(chang)期保存(cun)(4℃)。

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