抗體(ti)的易接近性(xing)

 

依據研究(jiu)抗原的特(te)性(xing)和(he)其制(zhi)備(bei)的方(fang)法，有些表(biao)位(wei)不易與(yu)抗體接(jie)近。抗(kang)體(ti)所識(shi)別(bie)的(de)同源表(biao)位(wei)空(kong)間(jian)封(feng)閉的zui常(chang)見原因是(shi)：①其(qi)他(ta)分(fen)子的(de)存在(zai)，特(te)別(bie)是(shi)已(yi)經結合(he)在(zai)抗(kang)原分子(zi)上(shang)的蛋白質(zhi)或核(he)酸(suan)可競(jing)爭性(xing)接近表(biao)位(wei)；②蛋白質(zhi)抗原的修飾(shi)，特(te)別(bie)是(shi)由(you)細胞(bao)調節(jie)控(kong)制(zhi)的(de)蛋白質(zhi)磷酸(suan)化(hua)；③如同在(zai)細胞(bao)或組織(zhi)染色中(zhong)發(fa)現(xian)的(de)復(fu)合(he)物(wu)中抗(kang)原定(ding)位(wei)問(wen)題。

 

(壹(yi))多聚體(ti)相(xiang)互(hu)作用

    壹種類(lei)型(xing)的(de)封(feng)閉是(shi)由(you)結合(he)在(zai)抗(kang)原分子(zi)上(shang)的其(qi)他分(fen)子所引起(qi)的(de)，這種(zhong)情(qing)況(kuang)是(shi)由(you)於蛋白—蛋白分(fen)子(zi)間(jian)的(de)相(xiang)互(hu)作用。如果(guo)在(zai)研究(jiu)中抗體(ti)識(shi)別(bie)的(de)表(biao)位(wei)與(yu)相(xiang)互(hu)作用的蛋白結合(he)位(wei)點重疊，就(jiu)檢測(ce)不到抗(kang)體(ti)—抗原間的(de)相(xiang)互(hu)結合(he)。這可(ke)以(yi)作為壹種方(fang)法來(lai)測定(ding)蛋白—蛋白分(fen)子(zi)間(jian)是(shi)否存在(zai)相(xiang)互(hu)作用。這種(zhong)表(biao)位(wei)競(jing)爭幾(ji)乎(hu)在(zai)任何(he)分子(zi)間相(xiang)互(hu)作用中都可以(yi)發(fa)現(xian)，但zui常(chang)見的是(shi)相(xiang)關(guan)大(da)分(fen)子間的(de)相(xiang)互(hu)作用，例如蛋白質(zhi)或者(zhe)核(he)酸(suan)。多聚體(ti)相(xiang)互(hu)作用是(shi)免(mian)疫(yi)染色、免(mian)疫(yi)沈澱和(he)免(mian)疫(yi)親(qin)和(he)純化(hua)中(zhong)常(chang)見的問(wen)題，但對免(mian)疫(yi)印(yin)跡(ji)來(lai)說則不多見，因為(wei)該(gai)技術中在(zai)

抗(kang)體(ti)加入之(zhi)前(qian)抗原已經*變(bian)性(xing)。

在(zai)不同免(mian)疫(yi)化(hua)學(xue)技術中抗(kang)體達到易(yi)接(jie)近性(xing)

對特異的抗體—抗(kang)原來(lai)說，多(duo)聚體(ti)相(xiang)互(hu)作用是(shi)影(ying)響(xiang)抗(kang)體(ti)識(shi)別(bie)表(biao)位(wei)的(de)重要因素(su)，所(suo)以通(tong)常(chang)情況下更換壹個識(shi)別(bie)不同表(biao)位(wei)的(de)抗體即可(ke)解決(jue)。如果(guo)缺乏有(you)關(guan)不同抗體結合(he)位(wei)點的(de)準確信(xin)息，簡(jian)單(dan)的方(fang)法是(shi)用(yong)抗(kang)體(ti)進(jin)行檢測(ce)。由(you)於多(duo)克隆(long)抗體通(tong)常(chang)在(zai)多(duo)個位(wei)點識(shi)別(bie)抗(kang)原，因此(ci)與(yu)抗原的結合(he)占(zhan)優勢，故多抗(kang)在(zai)解決(jue)多(duo)聚體(ti)相(xiang)互(hu)作用問題時(shi)成(cheng)為(wei)。解決(jue)這個問(wen)題的(de)第二(er)種辦(ban)法是(shi)在(zai)加入抗(kang)體之(zhi)前(qian)破壞(huai)多聚體(ti)的相(xiang)互(hu)作用。絕大部分(fen)蛋白—DNA、蛋白-RNA以(yi)及蛋白—蛋白分(fen)子(zi)間(jian)的(de)相(xiang)互(hu)作用，可以通(tong)過加入400mmol／L或(huo)更高濃度的(de)鹽就(jiu)能(neng)破壞(huai)，同時(shi)也(ye)破壞(huai)了抗(kang)原的結構，但絕大部分(fen)抗體(ti)對抗原仍(reng)保(bao)持活性(xing)。對於多聚體(ti)更強(qiang)的(de)相(xiang)互(hu)作用，可采用(yong)更劇烈(lie)的(de)條件(jian)來(lai)破壞(huai)抗原—競爭(zheng)物(wu)之間(jian)的(de)關(guan)系(xi)。

 

(二(er))蛋白質(zhi)抗原翻譯後的(de)修飾(shi)

    阻礙抗體與(yu)同源蛋白質(zhi)抗原結合(he)的(de)另壹因素(su)是(shi)翻(fan)譯後的(de)修飾(shi)，這種(zhong)情(qing)況(kuang)以蛋白磷酸(suan)化(hua)zui為(wei)常(chang)見，它(ta)能(neng)封(feng)閉某(mou)些單抗與(yu)抗原結合(he)。由(you)於這是(shi)影(ying)響(xiang)細胞(bao)或細胞(bao)群內蛋白的(de)亞(ya)單(dan)位(wei)，通(tong)常(chang)情況下這種(zhong)抗(kang)原結構的(de)空(kong)間(jian)變(bian)化(hua)只(zhi)會(hui)減少信(xin)號(hao)的(de)強(qiang)度。然(ran)而在(zai)某(mou)些情況下(xia)抗(kang)原可被(bei)*修飾(shi)，從(cong)而阻礙了抗體(ti)與(yu)相(xiang)應(ying)抗(kang)原的結合(he)。可(ke)以(yi)更換抗體(ti)或(huo)用酶處(chu)理蛋白質(zhi)抗原除去修飾(shi)來(lai)解決(jue)這壹(yi)問(wen)題，例(li)如在(zai)蛋白質(zhi)抗原磷酸(suan)化(hua)的(de)情(qing)況(kuang)下可用(yong)磷酸(suan)酶處(chu)理。

(三)定(ding)位(wei)

    抗(kang)體易接近性(xing)的第(di)三類(lei)問(wen)題是(shi)由(you)抗原定(ding)位(wei)引起(qi)，例(li)如免(mian)疫(yi)染色。如果(guo)抗原被包(bao)埋在(zai)壹(yi)個復(fu)合(he)物(wu)結構中(zhong)，或者(zhe)由(you)於壹(yi)個障礙性(xing)的細胞(bao)結構，從(cong)物(wu)理性(xing)狀上(shang)講抗體不易與(yu)抗原結合(he)，這是(shi)細胞(bao)或組織(zhi)染色中(zhong)*的(de)問(wen)題。

    解決(jue)這類(lei)問(wen)題比(bi)較(jiao)困(kun)難，需(xu)要分(fen)別(bie)對待(dai)，因為(wei)在(zai)每(mei)壹(yi)種(zhong)情(qing)況下阻礙抗體達到抗(kang)原的機(ji)制(zhi)是(shi)不壹樣的(de)，均(jun)需(xu)要作為壹個單(dan)獨的(de)問題來(lai)考慮。解決(jue)這些抗體易(yi)接(jie)近性(xing)的各(ge)種方(fang)法都涉及采用(yong)某(mou)些物(wu)理手段(duan)破壞(huai)幹擾結構。zui常(chang)用的兩種(zhong)方(fang)法是(shi)部分(fen)蛋白溶解和(he)微波(bo)處理。部分(fen)蛋白溶解是(shi)有(you)目(mu)的(de)地去除抑制(zhi)結構而(er)使(shi)靶(ba)抗(kang)原不受(shou)影(ying)響(xiang)，為(wei)使(shi)蛋白溶解更加有效(xiao)，需(xu)要調節(jie)蛋白酶(mei)的(de)用(yong)量及孵育(yu)時(shi)間(jian)。通(tong)過固定(ding)方(fang)法可以(yi)提供(gong)某(mou)些幫助，因為(wei)從(cong)物(wu)理上講(jiang)抗(kang)原的許(xu)多(duo)區(qu)域(yu)是(shi)通(tong)過交(jiao)聯結合(he)在(zai)鄰(lin)近結構上(shang)的，所(suo)以(yi)即使(shi)發(fa)生(sheng)某(mou)種(zhong)抗原的蛋白溶解剪(jian)接，至(zhi)少部分(fen)抗原仍(reng)連(lian)接(jie)在(zai)其(qi)他(ta)局(ju)部結構上(shang)。雖(sui)然(ran)如此(ci)，只(zhi)有在(zai)空(kong)間(jian)上達到易(yi)接(jie)近性(xing)才是(shi)壹(yi)個有(you)效(xiao)的(de)方(fang)法。

    達到易(yi)接(jie)近性(xing)的第(di)二個常(chang)用辦法是(shi)用(yong)微波(bo)處理樣本(ben)，適(shi)當地通(tong)過細胞(bao)結構部分(fen)變(bian)性(xing)以達到目(mu)的(de)。但需(xu)要仔(zai)細調節(jie)微波(bo)處理的時(shi)間(jian)和(he)強(qiang)度，以(yi)便使(shi)抗體(ti)達到易(yi)接(jie)近性(xing)，但又不破壞(huai)抗原或可(ke)識(shi)別(bie)的(de)細胞(bao)形(xing)態(tai)學(xue)。