禽流(liu)感(gan)的(de)實驗(yan)室診斷(duan)

    對(dui)於禽流(liu)感(gan)傳(chuan)統(tong)的(de)病原(yuan)學(xue)診斷(duan)方(fang)法(fa)是用(yong)雞(ji)胚(pei)或(huo)者(zhe)狗腎(shen)細(xi)胞（MDCK）、雞(ji)胚(pei)成纖(xian)維(wei)細胞(bao)（CEF）等進行病毒(du)分離(li)，采(cai)用(yong)血(xue)凝和(he)血(xue)凝抑(yi)制進行鑒(jian)定，血(xue)清(qing)學(xue)的(de)診斷(duan)方(fang)法(fa)則包括(kuo)中(zhong)和(he)試驗和(he)瓊(qiong)脂(zhi)擴(kuo)散(san)試驗等(deng)。近(jin)年來，隨著免(mian)疫學(xue)和(he)分子生物(wu)學(xue)技(ji)術(shu)的(de)飛(fei)速發展，禽流(liu)感(gan)的(de)診斷(duan)技(ji)術(shu)也(ye)越(yue)來越(yue)完善，現在(zai)已(yi)經有(you)免(mian)疫印(yin)跡、免(mian)疫熒(ying)光(guang)、ELISA、墓因芯片(pian)、RT-PCR技(ji)術(shu)、熒(ying)光(guang)RT-PCR技(ji)術(shu)、NASBA技(ji)術(shu)等(deng)。

如果(guo)要檢驗是否是高(gao)致(zhi)病性禽流(liu)感(gan)病毒(du)，在(zai)進(jin)行HA亞型(xing)鑒(jian)定之後(hou)，還(hai)需要進行細胞(bao)培養(yang)、動(dong)物(wu)試驗或(huo)進行裂解位(wei)點(dian)的(de)序(xu)列分析(xi)等進(jin)行判(pan)斷(duan)。因(yin)為(wei)OIE判(pan)斷(duan)HPAIV的(de)標(biao)準(zhun)是：①含(han)流感(gan)病毒(du)尿(niao)囊(nang)液，做(zuo)l：10稀釋，靜脈(mai)內(nei)接(jie)種8只4～8周(zhou)齡易(yi)感(gan)雞(ji)，每只0．2ml，如在(zai)10天(tian)內(nei)死亡6只以上，則該流(liu)感(gan)病毒(du)為(wei)HPAIV~②如果(guo)致(zhi)死l壹5只易(yi)感(gan)雞(ji)，而且又(you)不是H5或(huo)H7亞型(xing)，則(ze)將(jiang)其(qi)接種雞(ji)胚(pei)成纖(xian)維(wei)細胞(bao)（CEF）或(huo)MDCK細胞，在(zai)沒(mei)有(you)胰酶(mei)的(de)情況下觀(guan)察是否產(chan)生細胞(bao)病理(li)變化，如不產生病理(li)變化，該流(liu)感(gan)病毒(du)就(jiu)不是HPAIV；③對於(yu)所(suo)有(you)的(de)低(di)致病性H5和H7亞型(xing)病毒(du)和(he)其(qi)他(ta)流感病毒(du)，如果(guo)在(zai)沒有胰酶(mei)的(de)條件(jian)下在(zai)細胞培養(yang)能(neng)生長，則(ze)必(bi)須(xu)測定血(xue)凝素(su)裂解部(bu)位(wei)的(de)氨基(ji)酸(suan)順序(xu)，如果(guo)相似(si)於(yu)其(qi)他(ta)的(de)HPAIV，存在(zai)多個堿(jian)性氨基(ji)酸(suan)序(xu)列，則該受(shou)檢病毒(du)被(bei)視(shi)為高(gao)致(zhi)病性。

 

    1．樣(yang)品采(cai)集

    樣(yang)品采(cai)集的(de)質(zhi)量(liang)是進行禽流(liu)感(gan)檢測(ce)的(de)關(guan)鍵。應從死禽和(he)處於急性發病期(qi)的(de)病禽采(cai)集樣(yang)品，樣(yang)品要具(ju)有典(dian)型(xing)性。采(cai)樣(yang)過程要註(zhu)意(yi)無菌操作，同時(shi)避(bi)免(mian)汙(wu)染(ran)環境。采(cai)樣(yang)人員(yuan)要按(an)NY／丁(ding)7（38要求(qiu)加(jia)強(qiang)個人防護(hu)。樣(yang)品的(de)保存和運(yun)輸(shu)也(ye)要按(an)照(zhao)有關(guan)的(de)規定和要求(qiu)進(jin)行。

    （1）病料(liao)樣(yang)品  至少從5只病禽和(he)病死禽中(zhong)采(cai)集病料(liao)樣(yang)品（發病群(qun)不足5只則(ze)全(quan)部(bu)采(cai)樣(yang)）。樣(yang)品應包括(kuo)：泄(xie)殖(zhi)腔(qiang)（新鮮(xian)糞(fen)尿樣(yang)）棉拭子(zi)和氣管(guan)棉拭子(zi)（置於(yu)緩(huan)沖(chong)液中(zhong)）；氣管(guan)和(he)肺(fei)的(de)混樣(yang)；腸(chang)管(guan)及(ji)內(nei)容(rong)物(wu)的(de)混樣(yang)；肝(gan)、脾(pi)、腎(shen)和(he)腦(nao)等其(qi)他(ta)組(zu)織樣(yang)品（不能(neng)混樣(yang)）。

    組(zu)織樣(yang)品、氣管(guan)棉拭子(zi)單獨(du)放(fang)人容器(qi)，容(rong)器中(zhong)盛放(fang)含(han)有抗(kang)生素(su)（pH值(zhi)為(wei)7．0～7．4）的(de)PBS液。抗(kang)生素(su)的(de)選(xuan)擇(ze)應視當(dang)地(di)情況而定，組(zu)織和(he)氣管(guan)拭(shi)子懸(xuan)液(ye)中(zhong)加(jia)入青(qing)黴(mei)素(su)（20001U／ml）、鏈黴(mei)素(su)（2mg／ml）或(huo)慶大(da)黴(mei)素(su)（50t~g／m1）。腸管(guan)及(ji)內(nei)容(rong)物(wu)、糞(fen)便樣(yang)品和泄(xie)殖(zhi)腔(qiang)棉拭子(zi)所(suo)用(yong)的(de)抗生素(su)濃(nong)度(du)應提(ti)高(gao)5倍(bei)（加(jia)入抗(kang)生素(su)後PBS液(ye)的(de)pH值(zhi)應調(tiao)至7．0-7．4）。

（2）血(xue)樣(yang)  分別采(cai)集至少10個病禽的(de)（急性發病期(qi)血(xue)清(qing)，如發病群(qun)不足10只則(ze)全(quan)部(bu)采(cai)樣(yang)），並要求(qiu)單獨(du)存(cun)放(fang)，不能(neng)混合(he)。

 

    2．病毒(du)的(de)分離(li)鑒(jian)定

    以無菌拭子(zi)采(cai)集氣管(guan)或(huo)泄殖(zhi)腔(qiang)病料(liao)或(huo)病變(bian)組(zu)織，研(yan)磨(mo)制成10％懸(xuan)液(ye)，經處理後接種9-11日(ri)齡SPF雞(ji)胚(pei)，收(shou)獲(huo)尿囊(nang)液測(ce)定血(xue)凝活(huo)性，若為陰性則應繼續(xu)盲傳(chuan)2～3代。對具(ju)有血(xue)凝活(huo)性的(de)尿囊(nang)液需(xu)先(xian)用(yong)ND抗(kang)血(xue)清(qing)做(zuo)HI試驗，以排除(chu)新城疫的(de)可能(neng)，即(ji)使(shi)ND陽(yang)性也(ye)應采(cai)用(yong)中(zhong)和(he)法繼續(xu)傳(chuan)代，看是否為(wei)ND與AIV混(hun)合感(gan)染(ran)。然後用(yong)免(mian)疫擴(kuo)散(san)等方(fang)法來檢(jian)測(ce)特異性核心(xin)抗(kang)原(yuan)NP或(huo)MP，然後用(yong)血(xue)凝抑(yi)制試驗和(he)神經氨(an)酸(suan)酶(mei)抑(yi)制試驗鑒(jian)定A型(xing)流(liu)感(gan)病毒(du)亞(ya)型(xing)。分離(li)鑒(jian)定的(de)同時(shi)，進行致病力(li)試驗，確(que)定毒(du)力(li)的(de)強(qiang)弱(ruo)。

    雞(ji)胚(pei)培養(yang)法(fa)的(de)優(you)點(dian)  雞(ji)胚(pei)的(de)組(zu)織分化程度(du)低(di)，可選(xuan)擇(ze)適當(dang)途徑接種，病毒(du)易(yi)復制，感染(ran)病毒(du)的(de)膜(mo)和(he)液體(ti)含(han)大(da)量病毒(du)；雞(ji)胚(pei)是個整(zheng)體(ti)，有神經血(xue)管(guan)的(de)分布及(ji)臟(zang)器(qi)的(de)構造(zao)；來源(yuan)充(chong)足，操作簡(jian)單，通(tong)常(chang)是無菌的(de)，對接(jie)種的(de)病毒(du)不產生抗體(ti)。3天可(ke)報告(gao)結果(guo)。病毒(du)分離(li)鑒(jian)定對AI的(de)診斷(duan)比(bi)較(jiao)確(que)實(shi)，但(dan)操作程序(xu)繁(fan)雜(za)，費(fei)用(yong)高(gao)，耗(hao)時費(fei)力(li)。