gⅥ-cDNA融(rong)合噬菌體親(qin)和(he)選(xuan)擇(ze)

 

     1噬菌體文庫的獲(huo)取和(he)純(chun)化(hua)

    在(zai)每輪淘選循環(huan)中的起始部(bu)分(fen)，（富(fu)集的(de)）Topl0F，細(xi)胞(bao)經輔(fu)助(zhu)噬菌體被(bei)雙(shuang)重(zhong)感染(ran)以便(bian)產生和(he)純(chun)化(hua)gⅥ—cDNAt噬菌粒顆(ke)粒，從而進(jin)行下壹輪的淘選。在淘選過程中，如果沒(mei)有特(te)異(yi)的緩(huan)沖(chong)液(ye)且噬菌體對(dui)誘餌(er)的(de)親和(he)力(li)較(jiao)高（如免(mian)疫(yi)親和(he)篩選），此時(shi)經雙(shuang)重(zhong)感染(ran)獲(huo)得(de)的(de)噬菌體顆(ke)粒並(bing)不(bu)壹定(ding)要(yao)純(chun)化。

 

    2生物(wu)素化的(de)誘(you)餌(er)的(de)制備(bei)

    用(yong)不(bu)同(tong)的配(pei)體標準化淘選的壹個方(fang)法(fa)是(shi)用普通的標記物(wu)（如生物(wu)素）來標記誘餌(er)，或使(shi)用鏈黴親(qin)和(he)素(su)包(bao)被的(de)酶(mei)聯(lian)免(mian)疫(yi)吸附實(shi)驗(yan)（ELISA）的(de)平板(ban)孔(kong)或小珠(zhu)來(lai)淘選。兩個有效(xiao)的(de)（氨(an)基(ji)反應的）生物(wu)素化試(shi)劑是(shi)二(er)硫化(hua)N—羥(qiang)基(ji)丁二(er)酰亞胺(an)生物(wu)素酯(zhi)（biotin disulfide N—hydrox—ysuccinimideester）和(he)生物(wu)素化氨(an)基(ji)己(ji)酸(suan)—N—羥(qiang)基丁二(er)酰亞胺(an)（biotinamidocaproate N—hydroxysuccinimide）（Sigma）。與後者(zhe)試(shi)劑相(xiang)比，前(qian)者(zhe)在生物(wu)素和(he)誘(you)餌(er)之(zhi)間有壹個可(ke)切(qie)斷(duan)的二(er)硫鍵(jian)，它(ta)是(shi)在生物(wu)淘選過程中特異(yi)抽提(ti)（用(yong)50mmol/L二(er)硫蘇(su)糖(tang)醇）噬菌體的(de)試(shi)劑，整(zheng)個生物(wu)素的水(shui)平(ping)可(ke)用HABA方(fang)法(fa)來(lai)評(ping)估(gu)。

 

    3用(yong)生物(wu)素化的(de)誘(you)餌(er)的(de)淘選過程

    在用(yong)生物(wu)素化的(de)誘(you)餌(er)來(lai)親和(he)純(chun)化(hua)gⅥ—cDNA噬菌體顆(ke)粒的標準過程中，用鏈黴親(qin)和(he)素(su)包(bao)被的(de)磁(ci)珠(zhu)預(yu)處(chu)理(li)噬菌粒文庫，以便(bian)首(shou)先除(chu)去(qu)與鏈黴素(su)非(fei)特(te)異(yi)結合(he)的(de)噬菌體顆(ke)粒。在第(di)三輪淘選後，個別(bie)克(ke)隆可(ke)用ELISA來分析(xi)或進行額(e)外的淘選過程。然(ran)而，必須註意到成功(gong)的(de)展示(shi)要求(qiu)pⅥ融(rong)合蛋(dan)白定(ding)位(wei)在(zai)外周(zhou)胞(bao)質上，正確(que)地(di)折疊並(bing)組(zu)合成完整(zheng)的噬菌體顆(ke)粒。這(zhe)樣(yang)的(de)話(hua)，如果表(biao)達pⅥ融(rong)合蛋(dan)白的(de)結合者(zhe)幹擾了選擇過(guo)程，那麽將會(hui)稀(xi)釋“非(fei)幹擾”結合者(zhe)的濃(nong)度。

 

    4免(mian)疫(yi)親和(he)淘選過程

    用抗(kang)血(xue)清來分(fen)離gⅥ—cDNA噬菌體顆(ke)粒，而且(qie)所(suo)需(xu)要的(de)抗(kang)血(xue)清是(shi)微量的（微升數(shu)量的）。