肉毒梭菌診(zhen)斷技術(shu)

 

   （1）檢驗(yan)程序(xu)  檢驗(yan)菌株(zhu)是(shi)否產(chan)生(sheng)肉毒毒素(su)，或汙染食品(pin)中是(shi)否有產(chan)毒素(su)的(de)肉毒梭菌存(cun)可(ke)按圖(tu)進(jin)行檢驗(yan)。

 

檢樣接(jie)種(zhong)肝湯35℃培養3天    檢樣接(jie)種(zhong)TPCYT肉湯2℃培養5天

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取(qu)液(ye)體部(bu)分7000r/min離(li)心(xin)30min

↓

取上清(qing)中過(guo)滅(mie)菌

↓              ↓                       ↓

血(xue)清(qing)學試(shi)驗(yan)  禽(qin)眼(yan)瞼閉合試(shi)驗(yan)  小白鼠(shu)腹(fu)腔註射及(ji)中(zhong)和試(shi)驗(yan)

    （2）檢驗(yan)方法

    ①毒素(su)提取(qu)和(he)濃縮。取引(yin)起(qi)中(zhong)毒的(de)食品(pin)、飼(si)料(liao)以(yi)及(ji)病(bing)死(si)動(dong)物的(de)胃(wei)內(nei)容(rong)物，用(yong)生(sheng)理鹽水做(zuo)成懸液(ye)或取(qu)培養液(ye)的(de)濾液(ye)500ml，可(ke)加(jia)5％明礬(fan)水溶(rong)液(ye)2．5ml（或l％羥(qiang)基氯化(hua)鋁(lv)5m1）。按壹個(ge)方(fang)向(xiang)輕輕(qing)攪(jiao)拌(ban)5min，靜(jing)置至結(jie)絮(xu)，經(jing)薄脫(tuo)脂棉(mian)層過(guo)濾。用(yong)lo壹15ml的(de)水洗(xi)下(xia)結(jie)絮(xu)，以(yi)1000r／mir離(li)心(xin)lmin（或待其自然沈(chen)降(jiang)），棄去上清(qing)液(ye)收集(ji)絮凝(ning)物，用(yong)pH6．5的(de)o．2％明膠(jiao)緩(huan)沖(chong)液(ye)溶解(jie)絮疑(yi)物。若(ruo)室(shi)溫超(chao)過(guo)25℃，應在(zai)冰(bing)浴中處理(li)標本，以(yi)免(mian)毒素(su)活性(xing)降(jiang)低。

    ②小(xiao)白(bai)鼠(shu)腹(fu)腔接(jie)種(zhong)法。取15～25g的(de)小白(bai)鼠(shu)分(fen)成3組，每(mei)組(zu)2～3只(zhi)。1組(zu)：腹(fu)腔(qiang)接(jie)種(zhong)被檢標本的(de)稀釋液(ye)o．5mi；2組：腹(fu)腔接(jie)種(zhong)經(jing)沸(fei)水浴處理10min的(de)被檢標本稀釋液(ye)o．5ml；3組：腹(fu)腔接(jie)種(zhong)被檢標本與(yu)等量(liang)不(bu)同稀釋率的(de)抗(kang)毒素(su)混合(he)液(ye)lml。觀察(cha)2～6h，之(zhi)後(hou)早(zao)晚(wan)2次，共觀(guan)察4天。若(ruo)1組的(de)小鼠(shu)出現(xian)明(ming)顯腹壁(bi)震(zhen)顫、縮陷、“失聲”（用(yong)鑷子夾(jia)尾(wei)巴(ba)時不(bu)能(neng)叫(jiao)）、隨後(hou)呼(hu)吸(xi)困難、眼(yan)球突出、zui後(hou)死(si)亡(wang)；而(er)2組(zu)、3組(zu)小(xiao)鼠(shu)仍(reng)然健活。這表明(ming)被檢標本中存(cun)在(zai)肉毒毒素(su)。

    ③禽(qin)眼(yan)瞼閉合試(shi)驗(yan)。在投有(you)小白(bai)鼠(shu)的(de)情況(kuang)下(xia)，可(ke)選(xuan)用(yong)禽(qin)類(lei)（如(ru)雞、鴿子等），做(zuo)眼(yan)瞼註射。接(jie)種(zhong)量可(ke)視(shi)禽(qin)的(de)大(da)小(xiao)選(xuan)用(yong)，壹般註射0.1～0.3ml。具(ju)體操(cao)作：用(yong)藍(lan)芯註射器從(cong)禽(qin)的(de)內眼(yan)角(jiao)向(xiang)下(xia)註射眼(yan)險皮(pi)下(xia)。註射後(hou)眼(yan)瞼隆(long)起(qi)，幾分鐘(zhong)後(hou)接(jie)種(zhong)液(ye)被吸(xi)收，眼(yan)瞼復(fu)原(yuan)。然後(hou)視(shi)註入(ru)液(ye)中的(de)毒素(su)含(han)量多(duo)少，導致閉(bi)合(he)時(shi)間的(de)早晚(wan)不(bu)同，毒素(su)含(han)量越(yue)多閉(bi)眼(yan)越快。如(ru)註入(ru)含(han)量為(wei)幾個(ge)小(xiao)鼠(shu)致(zhi)死量的(de)毒素(su)，壹般可(ke)使(shi)試(shi)驗(yan)動(dong)物在(zai)1-l0h內(nei)出現(xian)閉(bi)眼(yan)癥狀；如(ru)毒素(su)量超(chao)過(guo)對(dui)禽(qin)體(ti)的(de)致死(si)量(liang)，則(ze)出現(xian)麻(ma)痹(bi)性(xing)癱瘓(huan)和(he)呼(hu)吸困難等癥(zheng)狀後(hou)經(jing)幾十(shi)分鐘(zhong)到(dao)幾小時死(si)亡(wang)；如(ru)註射後(hou)20rain內(nei)出現(xian)死(si)亡(wang)，應判(pan)斷為註射失敗。

    ④血清(qing)學試(shi)驗(yan)

    反(fan)向(xiang)間接(jie)血(xue)凝(ning)試(shi)驗(yan)  用(yong)各型抗(kang)毒素(su)致敏(min)已(yi)固(gu)定、鞣化(hua)的(de)人紅(hong)細(xi)胞(bao)。即可(ke)用(yong)於毒素(su)檢測。本法可(ke)將(jiang)毒素(su)分型，且(qie)有(you)較(jiao)高(gao)的(de)特異(yi)性(xing)和敏(min)感性(xing)。

    對流(liu)免(mian)疫(yi)電泳(yong)  用(yong)pH8，6的(de)巴(ba)比(bi)妥緩(huan)沖液(ye)配制(zhi)1％的(de)瓊脂糖(tang)凝(ning)膠(jiao)鋪於7cm×10cm玻璃(li)板(ban)上，打(da)出相距6mm的(de)兩列(lie)孔。其(qi)中壹列分(fen)別加入(ru)被檢樣品稀(xi)釋液(ye)、標準毒素(su)稀釋液(ye)20,uL；另壹列加(jia)入(ru)抗(kang)毒素(su)血清(qing)20uL。在60mA、6～8V/cm條件下(xia)電泳(yong)45-60min，觀察有無沈澱(dian)線出現(xian)。本法重(zhong)復(fu)性(xing)好，但其(qi)敏(min)感性(xing)不(bu)如(ru)反(fan)向(xiang)間接(jie)血(xue)凝(ning)法。

 

    ELISA多用(yong)雙(shuang)抗(kang)體(ti)夾(jia)心(xin)法檢測肉毒毒素(su)

    其方(fang)法為在(zai)聚(ju)苯(ben)乙(yi)烯(xi)酶(mei)標反(fan)應板(ban)上先加抗(kang)毒素(su)血清(qing)包被過(guo)夜(ye)，洗(xi)滌(di)後(hou)，加(jia)入(ru)待檢標本，37℃下(xia)孵(fu)育90min，再經(jing)洗滌(di)後(hou)加(jia)入(ru)兔的(de)抗(kang)毒素(su)血清(qing)，37℃孵(fu)育90min，再次洗滌(di)後(hou)加(jia)入(ru)羊(yang)抗(kang)兔(tu)IgG-酶(mei)結(jie)合(he)物，37℃孵(fu)育90min，洗滌後(hou)加(jia)入(ru)底物溶(rong)液(ye)，其他操(cao)作同ELISA常規(gui)法。

 

    人類(lei)肉毒中毒主要(yao)有3種(zhong)類(lei)型。a食(shi)物性(xing)肉毒中毒。主要(yao)是由(you)於(yu)進(jin)食(shi)了含(han)有肉毒毒素(su)的(de)食品(pin)引(yin)起(qi)的(de)，也是(shi)人(ren)類(lei)肉毒中毒的(de)zui普遍(bian)的(de)壹種形(xing)式。b嬰(ying)兒(er)肉毒中毒。由於(yu)新生(sheng)兒正(zheng)常腸(chang)道菌群(qun)缺(que)乏，其食(shi)人(ren)的(de)肉毒梭菌芽(ya)孢可(ke)以(yi)萌(meng)發(fa)、繁殖(zhi)、產(chan)生(sheng)毒素(su)，從(cong)而引(yin)起(qi)嬰(ying)兒(er)中(zhong)毒。c創(chuang)傷性(xing)肉毒中毒，類似(si)於破傷風，由於傷口處汙染的(de)肉毒梭菌芽(ya)孢繁殖(zhi)、產(chan)毒，毒素(su)從(cong)傷口進入血(xue)液(ye)循環(huan)而導(dao)致，臨(lin)床上較(jiao)少見(jian)。

 

    肉毒中毒的(de)實驗(yan)室(shi)診(zhen)斷和定(ding)型主(zhu)要(yao)是依據肉毒毒素(su)、病(bing)原(yuan)菌的(de)檢出，在此基礎上進行產(chan)毒試(shi)驗(yan)和診(zhen)斷血清(qing)的(de)中和(he)試(shi)驗(yan)。按GB／T4789.12-2003的(de)方法規(gui)定要求(qiu)，壹個(ge)在(zai)流行病(bing)學(xue)調(tiao)查和(he)臨(lin)床診(zhen)斷上已明確的(de)食物中(zhong)毒，其樣品在(zai)實(shi)驗(yan)室(shi)的(de)確診(zhen)上所需的(de)zui少時間是10天。