制備scFv接頭(tou)DNA

●  PCR試劑和設備

●  1ug任何(he)舍有scFv及（GIy₄Ser）₃接頭(tou)的(de)載體(ti)

●  RHuJ_H引(yin)物、RHuVκ引(yin)物(wu)和RHuVλ引物，10pmol/ul

 

[方法]

1．在0．5ml微(wei)量(liang)離心(xin)管內(nei)配制用(yong)於(yu)擴(kuo)增的(de)主混(hun)合(he)液(ye)。所(suo)顯(xian)示的主混(hun)合(he)液(ye)用(yong)於(yu)V_H—Vκ接頭。對於(yu)V_H—Vλ接頭的(de)主混(hun)合(he)液(ye)，n＝29。

                        單(dan)個(ge)反應主混(hun)合(he)液(ye)/ul         （n＝25）

●  水(shui)                     37                         925

●  10×Vent緩(huan)沖(chong)液        5．0                        125

●  20×dNTPs             2．5                        62．5

●  Vent DNA聚合(he)酶        0．5                        12．5

2．取24支0．5ml試(shi)管(guan)，每(mei)管分(fen)別加入(ru)RHuJ_H引物(wu)和RHuVκ引物，各2ul。RHuJ_H引物(wu)和RHuVκ引物共有24種可(ke)能(neng)的(de)結合(he)形(xing)式。而(er)對於(yu)V_H—Vλ接頭，則(ze)用RHuVl引(yin)物替代(dai)RHuVκ引(yin)物(wu)即可(ke)，共(gong)可(ke)編(bian)為(wei)28管。如(ru)無加熱(re)蓋(gai)，可(ke)以(yi)加入(ru)l滴輕(qing)質(zhi)礦(kuang)物油覆蓋(gai)反應液。

3．設1個陰性(xing)對照管，加入(ru)50ul主混(hun)合(he)液(ye)。

4．每(mei)個(ge)樣本取1．0ul scFv基因模(mo)板（約(yue)1ng），加入(ru)到主混(hun)合(he)液(ye)中(zhong)。

5．取46u1主混(hun)合(he)液(ye)分(fen)別加入(ru)到步(bu)驟2已(yi)制備的24個(ge)管(guan)內(nei)。

6．預加熱(re)PCR反應格到94℃。

7．以(yi)94℃ 1分(fen)鐘、55℃ 1分(fen)鐘、72℃1分(fen)鐘的(de)條件(jian)共循(xun)環25次，擴(kuo)增接(jie)頭(tou)序列(lie)。

8．將(jiang)PCR產(chan)物(wu)用2．0％TBE瓊脂糖(tang)膠電(dian)泳純化(hua)，切取PCR產(chan)物(wu)；用Geneclean抽提(ti)，並(bing)重(zhong)懸(xuan)DNA於(yu)50ul水(shui)中(zhong)。