以(yi)DIG 標定(ding)核酸探(tan)針

 

    前(qian)者(zhe)以(yi) [γ-32P] ATP為phosphate donor，利用T4 polynucleotide kinase的活性對(dui)帶有5’-OH的DNA進行標定(ding)。人(ren)工(gong)合成的寡(gua)核苷(gan)酸(suan) （oligonucleotides） 5’端(duan)為-OH group，可(ke)直(zhi)接用於(yu)kinase reaction；壹般DNA片(pian)段(duan)，若5’端(duan)帶(dai)有phosphate group，先經(jing)phosphatase處理，再(zai)進行kinase reaction。 Filling-in reaction是(shi)將DNA以(yi)特定(ding)限(xian)制(zhi)酶切(qie)開，露出(chu)recessed 3’ termini後，利用Klenow的活性把3’端(duan)補齊 （filling-in）；因此，只(zhi)要加入(ru)適當的 [α-32P] dNTP，即可(ke)在(zai)DNA的3’端(duan)進(jin)行標定(ding)。

 

    此外(wai)，也可(ke)以(yi)應(ying)用bacteriophage T4 DNA polymerase 的3’→5’ exonuclease 活性制(zhi)造(zao)recessed 3’termini，再進行filling-in。 至於(yu)正(zheng)意(yi)股(gu)或(huo)反意股RNA探針，則(ze)可(ke)以(yi) [α-32P] UTP或DIG-11-UTP等(deng)為標定(ding)物(wu)質(zhi)，應(ying)用胞外(wai)轉錄(lu)反應(ying)加(jia)以(yi)標定(ding)。 下面要介(jie)紹(shao)的是(shi)目前(qian)zui常用的方(fang)法(fa)：random priming及PCR。