TeloTAGGG™ 端粒長(chang)度(du)檢(jian)測(ce)試(shi)劑盒(he)

端粒是位於(yu)真核(he)細(xi)胞(bao)染(ran)色體(ti)末端的(de)特(te)殊DNA蛋(dan)白(bai)結(jie)構(gou)，由(you)小串聯重(zhong)復(fu)DNA序(xu)列組成。已(yi)有許(xu)多端粒序(xu)列經過鑒定，顯示(shi)其(qi)具有(you)非(fei)常少(shao)的序(xu)列變(bian)異(yi)，甚(shen)至(zhi)是在系(xi)統(tong)發(fa)育(yu)存(cun)在差異(yi)的(de)生物(wu)體(ti)之(zhi)間，如四(si)膜(mo)蟲（序(xu)列：TTGGGG)和人(ren)類(lei)（序(xu)列：TTAGGG)。
由(you)於(yu)DNA聚合酶(mei)不能(neng)復制線性DNA的末端，因此(ci)，有(you)人(ren)認(ren)為(wei)每個(ge)復制(zhi)周期都(dou)會導(dao)致染(ran)色體(ti)末端逐(zhu)漸縮(suo)短（稱為(wei)“末端復(fu)制(zhi)問(wen)題(ti)"）。已(yi)在體(ti)外(wai)和體內經過證實的(de)這種現(xian)象(xiang)，似(si)乎(hu)與(yu)正常體細胞(bao)的(de)有限(xian)增(zeng)殖(zhi)能(neng)力（“有(you)絲(si)分(fen)裂(lie)鐘(zhong)"）有關(guan)。由於(yu)生殖(zhi)細(xi)胞(bao)、幹細胞(bao)和腫瘤細(xi)胞(bao)都(dou)表現(xian)出具有(you)延長(chang)甚(shen)至(zhi)無限(xian)的壽命(ming)，因此(ci)有(you)人(ren)提出(chu)這些(xie)細(xi)胞(bao)必(bi)須具有(you)維(wei)持(chi)端粒長(chang)度(du)的特定機制(zhi)。
保(bao)持(chi)穩定的端粒長(chang)度(du)與端粒酶(mei)的激(ji)活(huo)有(you)關。該(gai)酶(mei)是壹種(zhong)核(he)糖(tang)核(he)蛋(dan)白(bai)，利(li)用(yong)其(qi)內在RNA組分(fen)作(zuo)為(wei)DNA合成的(de)模(mo)板，通(tong)過(guo)在染(ran)色體(ti)末端添加重復序(xu)列來(lai)補償(chang)端粒DNA的丟(diu)失。
端粒通(tong)過(guo)與結構(gou)蛋(dan)白(bai)發(fa)生特(te)異(yi)性結合，對(dui)維(wei)持(chi)真核(he)細(xi)胞(bao)內(nei)染(ran)色體(ti)的(de)穩定性具有(you)重要(yao)作(zuo)用(yong)。這些(xie)蛋(dan)白(bai)質(zhi)可(ke)以(yi)封(feng)閉線(xian)性染(ran)色體(ti)的(de)末端，防止(zhi)核(he)降(jiang)解、染(ran)色體(ti)末端融(rong)合、不規(gui)則(ze)重組以及(ji)其(qi)他(ta)通(tong)常對(dui)細(xi)胞(bao)致(zhi)命(ming)的(de)事件(jian)。
對(dui)人(ren)類(lei)外周血單核(he)細(xi)胞(bao)研(yan)究樣本中(zhong)端粒長(chang)度(du)的分(fen)析(xi)揭示(shi)了端粒長(chang)度(du)隨(sui)供(gong)體年齡的(de)增(zeng)加而降低(di)，反(fan)映了這些(xie)細(xi)胞(bao)的(de)復制(zhi)史。已(yi)在多(duo)種(zhong)疾病（如，唐氏綜合征(zheng)、共濟(ji)失(shi)調性毛(mao)細血管(guan)擴張(zhang)和HIV感染(ran)）中(zhong)發(fa)現(xian)存(cun)在端粒丟失(shi)加速(su)的(de)現(xian)象(xiang)，表明端粒長(chang)度(du)縮(suo)短可能(neng)與這些(xie)疾(ji)病相(xiang)關的(de)免(mian)疫(yi)功(gong)能(neng)障礙有關。該(gai)試(shi)劑盒(he)用(yong)於進(jin)壹步(bu)了解(jie)關(guan)於(yu)這些(xie)關(guan)系(xi)的科(ke)學(xue)知識。

分(fen)析(xi)時(shi)間：約18小(xiao)時(shi)
樣(yang)品材(cai)料(liao)：細胞(bao)培(pei)養(yang)物和其(qi)他(ta)生物(wu)樣(yang)品

用(yong)於測(ce)定端粒長(chang)度(du)的非(fei)放(fang)射性化學(xue)發(fa)光檢(jian)測(ce)法(fa)。

該(gai)試(shi)劑盒(he)對(dui)末端限(xian)制性片段(duan)（TRF）進(jin)行(xing)Southern分(fen)析(xi)，這些(xie)片(pian)段(duan)是利(li)用(yong)頻繁(fan)切(qie)割(ge)限(xian)制性內切(qie)酶(mei)消(xiao)化(hua)基因組DNA而獲(huo)得(de)的。
第(di)1步(bu)：基因組DNA的消(xiao)化(hua)
使用(yong)優化(hua)的(de)頻繁(fan)切(qie)割(ge)限(xian)制性內切(qie)酶(mei)混合物消(xiao)化(hua)純(chun)化(hua)的(de)基(ji)因組DNA。選擇(ze)的(de)酶(mei)不會(hui)切(qie)割(ge)端粒DNA和亞端粒DNA。這是因為重復序(xu)列具有(you)特殊(shu)序(xu)列特(te)征(zheng)。非(fei)端粒DNA被(bei)消(xiao)化(hua)成低分(fen)子量片(pian)段(duan)。
第(di)2步(bu)：凝(ning)膠(jiao)電泳(yong)和Southern印跡
在DNA消(xiao)化(hua)後，通(tong)過(guo)凝(ning)膠(jiao)電泳(yong)分(fen)離(li)DNA片段(duan)，然後(hou)通(tong)過(guo)Southern印跡將其(qi)轉(zhuan)印至(zhi)尼(ni)龍膜(mo)上。
第(di)3步(bu)：雜(za)交(jiao)和化學(xue)發(fa)光檢(jian)測(ce)
轉(zhuan)印的DNA片段(duan)與端粒重復(fu)序(xu)列的(de)特(te)異(yi)性DIG標記(ji)探(tan)針雜(za)交(jiao)，然(ran)後(hou)使用(yong)與堿(jian)性磷(lin)酸(suan)酶(mei)共價連(lian)接的DIG特異(yi)性抗體(ti)孵育(yu)。最後(hou)，使用(yong)堿性磷(lin)酸(suan)酶(mei)的高靈(ling)敏(min)度(du)化(hua)學(xue)發(fa)光底(di)物(wu)CDP-Star，使固(gu)定的端粒探(tan)針顯色。通(tong)過(guo)對(dui)比信(xin)號與分(fen)子量標準(zhun)品，可(ke)確定平均(jun)TRF長(chang)度(du)。

TeloTAGGG^™ Telomere Length Assay被(bei)設計(ji)用(yong)於以(yi)下(xia)生命(ming)科(ke)學(xue)研(yan)究應用(yong):

• 靈(ling)敏(min)檢(jian)測(ce)細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)物和其(qi)他(ta)生物(wu)研(yan)究樣品中(zhong)的(de)端粒DNA（端粒序(xu)列：TTAGGG)[1]

• 檢(jian)測(ce)細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)物和其(qi)他(ta)生物(wu)研(yan)究樣品中(zhong)DNA的(de)端粒長(chang)度(du)[2][3][4]

1個(ge)試劑(ji)盒(he)包(bao)含15種組分(fen)。

探(tan)針的序(xu)列和長(chang)度(du)保(bao)密。試劑(ji)盒(he)中(zhong)的(de)DIG標記(ji)MW是DIG MW III和VII的混合物

工作(zuo)濃(nong)度(du)：結(jie)合物的(de)工作(zuo)濃(nong)度(du)取(qu)決(jue)於(yu)應用(yong)和底(di)物(wu)

以下(xia)濃度(du)應作(zuo)為(wei)使用(yong)指南：

• 斑(ban)點(dian)雜(za)交(jiao)印跡：100 ng/ml

• ELISA：100 ng/ml

• 蛋白(bai)質(zhi)免(mian)疫(yi)印跡：100 ng/ml

工作(zuo)濃(nong)度(du)：TAE緩(huan)沖液(ye)
0.04 M Tris-乙(yi)酸(suan)，0.001 M EDTA，pH 8.0
HCl溶液(ye)
0.25 M HCl
壹個(ge)200 cm² 的印跡需(xu)要(yao)約250 ml溶(rong)液(ye)。
變(bian)性 溶液(ye)
0.5 M NaOH，1.5 M NaCl
壹個(ge)200 cm² 印跡需(xu)要(yao)約500 ml溶(rong)液(ye)。
中(zhong)和液(ye)
0.5 M Tris-HCl,3 M NaCl,pH 7.5
壹個(ge)200 cm² 印跡需(xu)要(yao)約500 ml溶(rong)液(ye)。
20x SSC
3 M NaCl,0.3 M檸(ning)檬(meng)酸(suan)鈉,pH 7.0
2x SSC
使用(yong)經高壓滅(mie)菌的重蒸(zheng)水稀(xi)釋20x SSC(溶(rong)液(ye)5)，稀(xi)釋比例(li)為(wei)1:10。
DIG Easy Hyb雜(za)交(jiao)顆(ke)粒
使用(yong)64 ml經高壓滅(mie)菌的重蒸(zheng)水重懸(xuan)顆(ke)粒（瓶8），並(bing)在37 °C孵育(yu)至(zhi)全重(zhong)懸(xuan)。臨(lin)用(yong)前幾小(xiao)時(shi)制(zhi)備溶液(ye)。
嚴(yan)格(ge)洗滌緩(huan)沖液(ye)I
2x SSC，0.1% SDS
嚴(yan)格(ge)洗滌緩(huan)沖液(ye)II
0.2x SSC，0.1% SDS
洗滌緩(huan)沖液(ye)，1x
使用(yong)經高壓滅(mie)菌的重蒸(zheng)水稀(xi)釋適(shi)量的(de)洗滌緩(huan)沖液(ye)10倍(bei)濃(nong)縮(suo)液(ye)（瓶10），稀(xi)釋比例(li)為(wei)1:10。
封(feng)閉液(ye)，1x
使用(yong)1x馬來(lai)酸(suan)緩(huan)沖液(ye)（溶(rong)液(ye)12）稀(xi)釋適(shi)量的(de)封(feng)閉液(ye)10倍(bei)濃(nong)縮(suo)液(ye)（瓶12），稀(xi)釋比例(li)為(wei)1:10。
馬來(lai)酸(suan)緩(huan)沖液(ye)，1×
使用(yong)經高壓滅(mie)菌的重蒸(zheng)水稀(xi)釋適(shi)量的(de)馬來(lai)酸(suan)緩(huan)沖液(ye)10倍(bei)濃(nong)縮(suo)液(ye)（瓶11），稀(xi)釋比例(li)為(wei)1:10。
DIG-AP抗體，工作(zuo)溶(rong)液(ye)
為(wei)減(jian)少(shao)聚集(ji)抗體(ti)產生的(de)背(bei)景，請在使用(yong)前將試劑瓶以(yi)13,000 rpm離(li)心5分(fen)鐘(zhong)。
使用(yong)1x封(feng)閉液(ye)（溶(rong)液(ye)11）將適量DIG-AP抗(kang)體(ti)（瓶13）溶(rong)液(ye)稀(xi)釋至(zhi)終濃(nong)度為(wei)75 mU/ml (1:10,000)。
檢(jian)測(ce)液(ye)，1x
使用(yong)經高壓滅(mie)菌的重蒸(zheng)水稀(xi)釋適(shi)量的(de)檢(jian)測(ce)液(ye)10倍(bei)濃(nong)縮(suo)液(ye)（瓶14），稀(xi)釋比例(li)為(wei)1:10。
儲存(cun)條(tiao)件(jian)（工作(zuo)溶(rong)液(ye)）：TAE緩(huan)沖液(ye)：
在15至(zhi)25 °C下穩定保(bao)存(cun)
HCl溶(rong)液(ye)
在15至(zhi)25 °C下穩定保(bao)存(cun)
變(bian)性 溶液(ye)
在15至(zhi)25 °C下穩定保(bao)存(cun)
中(zhong)和液(ye)
在15至(zhi)25 °C下穩定保(bao)存(cun)
20x SSC
在15至(zhi)25 °C下穩定保(bao)存(cun)
2x SSC
在15至(zhi)25 °C下穩定保(bao)存(cun)
DIG Easy Hyb雜(za)交(jiao)顆(ke)粒
在15至(zhi)25 °C下穩定保(bao)存(cun)3個(ge)月(yue)
嚴格(ge)洗滌緩(huan)沖液(ye)I
在15至(zhi)25 °C下穩定保(bao)存(cun)
嚴(yan)格(ge)洗滌緩(huan)沖液(ye)II
在15至(zhi)25 °C下穩定保(bao)存(cun)
洗滌緩(huan)沖液(ye)，1x
在15至(zhi)25 °C下穩定保(bao)存(cun)
封(feng)閉液(ye)，1x
臨(lin)用(yong)前配(pei)制。請勿(wu)儲存(cun)
馬來(lai)酸(suan)緩(huan)沖液(ye)，1×
在15至(zhi)25°C下穩定保(bao)存(cun)。
DIG-AP抗(kang)體(ti)，工作(zuo)溶(rong)液(ye)
臨(lin)用(yong)前配(pei)制。請勿(wu)儲存(cun)
檢(jian)測(ce)液(ye)，1x
在15至(zhi)25°C下穩定保(bao)存(cun)