realtimeprimers qPCR 預混液

概(gai)述(shu) - 定(ding)量(liang)“實時(shi)"PCR 或(huo) qPCR

定(ding)量(liang)實時(shi) PCR 改變了我們測(ce)量(liang)核酸濃(nong)度的能(neng)力(li)，並(bing)且是驗(yan)證(zheng)微陣列(lie)分析(xi)和(he)其他(ta)基因組(zu)技術(shu)生成(cheng)的表(biao)達(da)數據(ju)的重要(yao)壹步(bu)。實(shi)時(shi) qPCR 儀(yi)器的開(kai)發(fa)促(cu)進了這壹點(dian)，該儀(yi)器可測(ce)量(liang)反應(ying)每個步(bu)驟或(huo)“實(shi)時"產(chan)生的 qPCR 產(chan)物的量(liang)。 SYBR green 因其相對簡(jian)單(dan)和(he)可(ke)靠而成(cheng)為(wei)目前(qian)流行的(de)實(shi)時(shi) PCR 方(fang)法(fa)。在實(shi)時 PCR 技術(shu)發(fa)展之(zhi)前，定量(liang)測(ce)量(liang)需(xu)要(yao)設置多個(ge) PCR 反(fan)應(ying)，以(yi)便(bian)在擴(kuo)增的(de)線性(xing)階(jie)段(duan)捕(bu)獲(huo) qPCR 產(chan)物。然後(hou)通(tong)過(guo)凝膠(jiao)電(dian)泳(yong)或(huo) HPLC 進行 PCR 產(chan)物的分離和(he)定(ding)量(liang)。這些實驗非常(chang)費力(li)，並(bing)且實現(xian)正(zheng)確(que)定(ding)量(liang)所需(xu)的(de)操作次(ci)數增(zeng)加了引(yin)入(ru)錯誤(wu)的可(ke)能(neng)性(xing)。因此，能(neng)夠(gou)在每個熱(re)循環(huan)測(ce)量(liang) PCR 產物的實(shi)時(shi) PCR 儀(yi)器的開(kai)發(fa)提高(gao)了定量(liang) PCR 的簡(jian)便(bian)性(xing)、準(zhun)確(que)性(xing)和(he)重(zhong)現(xian)性(xing)。由(you)於(yu)實(shi)時(shi) PCR 的(de)發(fa)現(xian)，出現(xian)了多種(zhong)應(ying)用。其中(zhong)包括(kuo) 1) 通(tong)過(guo)微陣列(lie)分析(xi)或(huo)下壹(yi)代測(ce)序(xu) (NGS) 獲(huo)得的(de)基因表達(da)數據(ju)的驗證(zheng)，2) DNA 拷(kao)貝數的(de)測(ce)量(liang)，3) 病毒(du)顆粒(li)和(he)潛(qian)在致命微生(sheng)物的檢(jian)測(ce)和(he)定(ding)量(liang)，4) 突(tu)變/SNP 分析(xi)，以(yi)及5）miRNA表(biao)達(da)。實(shi)時 PCR 儀(yi)器的開(kai)發(fa)可以(yi)在每個熱(re)循環(huan)中測(ce)量(liang) PCR 產物，從而(er)提高(gao)了定量(liang) PCR 的簡(jian)便(bian)性(xing)、準(zhun)確(que)性(xing)和(he)重(zhong)現(xian)性(xing)。由(you)於(yu)實(shi)時(shi) PCR 的(de)發(fa)現(xian)，出現(xian)了多種(zhong)應(ying)用。其中(zhong)包括(kuo) 1) 通(tong)過(guo)微陣列(lie)分析(xi)或(huo)下壹(yi)代測(ce)序(xu) (NGS) 獲(huo)得的(de)基因表達(da)數據(ju)的驗證(zheng)，2) DNA 拷(kao)貝數的(de)測(ce)量(liang)，3) 病毒(du)顆粒(li)和(he)潛(qian)在致命微生(sheng)物的檢(jian)測(ce)和(he)定(ding)量(liang)，4) 突(tu)變/SNP 分析(xi)，以(yi)及5）miRNA表(biao)達(da)。實(shi)時 PCR 儀(yi)器的開(kai)發(fa)可以(yi)在每個熱(re)循環(huan)中測(ce)量(liang) PCR 產物，從而(er)提高(gao)了定量(liang) PCR 的簡(jian)便(bian)性(xing)、準(zhun)確(que)性(xing)和(he)重(zhong)現(xian)性(xing)。由(you)於(yu)實(shi)時(shi) PCR 的(de)發(fa)現(xian)，出現(xian)了多種(zhong)應(ying)用。其中(zhong)包括(kuo) 1) 通(tong)過(guo)微陣列(lie)分析(xi)或(huo)下壹(yi)代測(ce)序(xu) (NGS) 獲(huo)得的(de)基因表達(da)數據(ju)的驗證(zheng)，2) DNA 拷(kao)貝數的(de)測(ce)量(liang)，3) 病毒(du)顆粒(li)和(he)潛(qian)在致命微生(sheng)物的檢(jian)測(ce)和(he)定(ding)量(liang)，4) 突(tu)變/SNP 分析(xi)，以(yi)及5）miRNA表(biao)達(da)。其中(zhong)包括(kuo) 1) 通(tong)過(guo)微陣列(lie)分析(xi)或(huo)下壹(yi)代測(ce)序(xu) (NGS) 獲(huo)得的(de)基因表達(da)數據(ju)的驗證(zheng)，2) DNA 拷(kao)貝數的(de)測(ce)量(liang)，3) 病毒(du)顆粒(li)和(he)潛(qian)在致命微生(sheng)物的檢(jian)測(ce)和(he)定(ding)量(liang)，4) 突(tu)變/SNP 分析(xi)，以(yi)及5）miRNA表(biao)達(da)。其中(zhong)包括(kuo) 1) 通(tong)過(guo)微陣列(lie)分析(xi)或(huo)下壹(yi)代測(ce)序(xu) (NGS) 獲(huo)得的(de)基因表達(da)數據(ju)的驗證(zheng)，2) DNA 拷(kao)貝數的(de)測(ce)量(liang)，3) 病毒(du)顆粒(li)和(he)潛(qian)在致命微生(sheng)物的檢(jian)測(ce)和(he)定(ding)量(liang)，4) 突(tu)變/SNP 分析(xi)，以(yi)及5）miRNA表(biao)達(da)。

壹(yi)般來說(shuo)，實(shi)時(shi) PCR 方(fang)案與(yu)標(biao)準 PCR 反應(ying)類似(si)。同樣的問題(ti)也(ye)適(shi)用(yong)於(yu)生(sheng)產(chan)幹(gan)凈的(de)模(mo)板、設計引(yin)物和(he)優(you)化反(fan)應(ying)條(tiao)件(jian)。主(zhu)要(yao)區別(bie)在於(yu)加入(ru)了 SYBR green 等(deng)嵌(qian)入(ru)劑(ji)或(huo)使(shi)用熒(ying)光引(yin)物來檢(jian)測(ce) PCR 產(chan)物。在典(dian)型的反(fan)應(ying)中，qPCR 產(chan)物的產(chan)生(sheng)呈(cheng)指(zhi)數的(de)增長(chang)。由(you)於(yu)需(xu)要(yao)幾個(ge)循環(huan)才能(neng)輕(qing)松(song)檢(jian)測(ce)到(dao)足(zu)夠的產物，因此熒(ying)光與(yu)循環(huan)數的(de)圖(tu)呈(cheng)現(xian) S 形外觀(guan)。在稍(shao)後(hou)的(de)循環(huan)中，反(fan)應(ying)底物耗(hao)盡(jin)，qPCR 產(chan)物不再(zai)加倍(bei)，並且曲線(xian)開(kai)始變平。曲(qu)線上熒(ying)光量(liang)開(kai)始快速增加的(de)點(dian)，通(tong)常(chang)比基線(xian)高(gao)幾(ji)個(ge)標(biao)準差，稱為(wei)閾(yu)值循環(huan)（Ct 值）。 Ct 與模(mo)板的關系(xi)圖(tu)是(shi)線(xian)性(xing)的(de)，因此比較多個(ge)反(fan)應(ying)之間的 Ct 值可以(yi)計算(suan)出(chu)目標(biao)核酸的濃(nong)度。這條(tiao)線(xian)的(de)斜(xie)率提供(gong)了 qPCR 效率的衡(heng)量(liang)標準(zhun)。

PCR產物可通(tong)過(guo)生(sheng)成(cheng)標(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)來定(ding)量(liang)或(huo)相對於(yu)對(dui)照(zhao)基因進行定(ding)量(liang)。基於(yu)標(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)的實時PCR定(ding)量(liang)可以(yi)利用(yong)質(zhi)粒(li)DNA或(huo)其他(ta)形式(shi)的(de)DNA，其中(zhong)每個標(biao)準的(de)絕(jue)對濃(nong)度是已(yi)知的。然(ran)而(er)，必(bi)須確(que)保(bao)標準(zhun)品(pin)的 PCR 效率(lv)與“未知"樣品的 PCR 效率(lv)相同。在某(mou)些情況下，從純(chun)化的(de)靶標中進行 PCR 比(bi)用(yong)復(fu)雜的(de)核酸混合物觀察(cha)到的(de)效(xiao)率(lv)更(geng)高(gao)。相對定(ding)量(liang)方(fang)法(fa)稍微簡(jian)單(dan)壹(yi)些，因為(wei)它(ta)需(xu)要(yao)測(ce)量(liang)管(guan)家(jia)或(huo)對(dui)照基因以(yi)使目標(biao)基因的表(biao)達標(biao)準(zhun)化。然(ran)而(er)，選擇適(shi)當(dang)的控(kong)制基因可能(neng)會(hui)引(yin)起(qi)問題(ti)，因為(wei)它(ta)們(men)不(bu)壹(yi)定(ding)在所(suo)有未知樣本中均等(deng)表(biao)達(da)。這(zhe)可(ke)以(yi)通(tong)過(guo)對(dui)壹(yi)組(zu)管(guan)家(jia)基因進行標(biao)準(zhun)化測(ce)量(liang)來避(bi)免(mian)，以(yi)避(bi)免(mian)這種(zhong)變異性(xing)問題(ti)。

進行實(shi)時(shi) PCR 的(de)壹個(ge)關鍵(jian)方(fang)面是(shi)從高(gao)純(chun)度的模板開(kai)始。在處(chu)理(li)某些生物樣品時，這可(ke)能(neng)具(ju)有(you)挑(tiao)戰性(xing)。幸(xing)運(yun)的(de)是(shi)，已(yi)經開(kai)發(fa)了許(xu)多商(shang)業產(chan)品(pin)來促(cu)進高(gao)純(chun)度核酸的分離。去(qu)除汙染性(xing)苯酚(fen)和(he)不(bu)需(xu)要(yao)的 DNA 是(shi)需(xu)要(yao)考(kao)慮(lv)的(de)步(bu)驟(zhou)。對於(yu)基因表達(da)研(yan)究(jiu)，必(bi)須使(shi)用(yong)高(gao)純(chun)度試劑(ji)並多次(ci)重(zhong)復(fu)進行逆轉錄(lu)，因為(wei)此步驟可(ke)能(neng)會(hui)引(yin)入(ru)模板復(fu)制的(de)變異性(xing)。逆轉錄(lu)可以(yi)在實(shi)時PCR之(zhi)前進行，或(huo)者可(ke)以(yi)並入(ru)擴增(zeng)程序(xu)中。

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