甲醛洋(yang)菜(cai)膠體(ti)電泳(yong)

 

    儀(yi)器(qi)用具：65℃恒(heng)溫水(shui)槽；微(wei)量離(li)心機；Mupid II 迷妳電(dian)泳槽(cao)及鑄膠器(qi)；UV transilluminator；防(fang)護(hu)面(mian)罩(zhao)；拍(pai)立得(de)相(xiang)機(ji)；抽(chou)氣櫥(chu)

 

 

    藥(yao)品(pin)試(shi)劑：

    自(zi)菌(jun)體(ti)抽(chou)取的(de)RNA （I-1, I-2, U-1, and U-2） 與(yu)胞(bao)外(wai)轉錄反(fan)應所(suo)制(zhi)備(bei)的(de)正意股及(ji)反(fan)意股RNA （#1, #2, #3, and #4）。

    5×formaldehyde gel running buffer （0.1 M MOPS, pH 7.0; 40 mM sodium acetate; 5 mM EDTA）

    Formaldehyde gel loading buffer （0.25% bromophenol blue; 0.25% xylene cyanol;50% glycerol; 1 mM EDTA）

    Ethidium bromide （1 μg/μL in dH2O/DEPC）

    dH₂O/DEPC

 

    方法步驟(zhou)：

    ◆ 註(zhu)意：

    a. 下列實驗主(zhu)要(yao)參照Sambrook and Russell （2001） 的方法。

    b. 進行下列實驗時請務(wu)必(bi)戴手套(tao)。

    c. 甲醛與formamide 都放(fang)在(zai)抽(chou)氣櫥(chu)內(nei)。

    準備(bei)壹(yi)片1.2%甲(jia)醛洋(yang)菜(cai)膠體(ti)：

    1） 秤取(qu)0.48 g agarose置100 mL血(xue)清瓶(ping)，加入(ru)25 mL dH2O/DEPC。

    2） 以微(wei)波(bo)爐加(jia)熱(re)溶(rong)解(jie)的後(hou)，微(wei)微(wei)晃動血(xue)清瓶(ping)使(shi)混合(he)均(jun)勻，再(zai)移(yi)至60℃恒(heng)溫水(shui)槽靜置5 min。

    3） 將裝(zhuang)著agarose 溶(rong)液(ye)的血(xue)清瓶(ping)移(yi)至抽(chou)氣櫥(chu)，加(jia)入(ru)8 mL 的5× formaldehyde gel running buffer 及7.2 mL 的甲醛，輕(qing)輕(qing)搖晃血(xue)清瓶(ping)以便混合(he)均(jun)勻。

􀂋  膠體(ti)總體(ti)積為40 mL，為了避免(mian)agarose 溶(rong)液(ye)因溫(wen)度快(kuai)速(su)下降，很快(kuai)便凝(ning)固，應(ying)力求(qiu)動作(zuo)迅(xun)速(su)，但應避免(mian)劇(ju)烈搖晃，以(yi)免弄出壹(yi)大(da)堆(dui)氣(qi)泡，影響(xiang)膠體(ti)凝(ning)結。

    4） 盡(jin)速(su)於(yu)抽(chou)氣櫥(chu)內(nei)把混合(he)液(ye)倒入(ru)膠體(ti)鑄模(mo)，並(bing)插入(ru)樣(yang)本梳(shu) （teeth comb）。膠體(ti)凝(ning)固至(zhi)少需時30 min。

    電(dian)泳(yong)：

    1） 要(yao)進行電(dian)泳時，把(ba)已(yi)凝(ning)固的(de)洋(yang)菜(cai)膠體(ti)放(fang)進電(dian)泳槽，並(bing)加(jia)入(ru)適量1×formadehyde gel running buffer。

    2） 以50 V 定(ding)電壓(ya)預(yu)跑5 min。

    3） 依(yi)序(xu)註入(ru)上列8 個RNA 樣(yang)本，以(yi)50 V 定(ding)電壓(ya)進行電(dian)泳，待(dai)追蹤染(ran)劑移(yi)動至(zhi)膠體(ti)三(san)分的(de)二(er)處時，關閉電(dian)源(yuan)，將膠體(ti)移(yi)至UV transilluminator box，觀察(cha)RNA 色(se)帶(dai)的存在(zai)情形，並(bing)拍(pai)照存證。

􀂋  註(zhu)意：這(zhe)壹片(pian)膠體(ti)往下將用來進行北方轉印實(shi)驗，請小心處置！